ต้องเริ่มที่การ graft หรือการสร้างเนื้อเยื่อใหม่ ไม่ว่าจะเป็น Connective tissue หรือ Bone graft หรือ Grafting materials ที่ได้จากการ synthesis อื่นๆ ในทุกสิ่งที่เราต้องการ augmentation ขึ้นมาสิ่งที่เราต้องการอย่างน้อย 2 สิ่ง คือ
1. cell หรือ material ที่เป็นต้นกำเนิด
2. space ที่เราต้องเตรียมไว้
(ในเทคโนโลยีของ Regenerative ในฝั่งของ dentistry เรามุ่งความสนใจไปที่ Regenerative endodontics เนื่องจาก pulp มีปริมาตรที่เล็กมาก (0.2-1 cc การสร้างให้กลับมาน่าจะง่ายกว่า organ ที่มีขนาดใหญ่และ function ซับซ้อน) requirement ของ Regenerative endodontics ประกอบด้วย stem cells, inducing factor (growth factor), scaffold)
เดิมนั้นปัญหาของ Graft คือ การ collapse (หรือแม้กระทั่ง relapse กลับสู่สภาพเดิม), การเกิด infection, ความไม่ compatible ของ graft กับร่างกายผู้ป่วย, Grafting materials ที่มีราคาแพง ตลอดจนความไม่แน่นอนในการทำนายผลที่ได้รับ และความยุ่งยากที่อาจต้องใช้ skill พิเศษในการ harvest graft (Autogenous graft)
การนำ PRF มาใช้ทำให้ขจัดอุปสรรคและข้อแทรกซ้อนที่เคยเจอ จะลดลงได้ 80-90%
PRF คืออะไร?
กล่าวโดยย่อที่สุด PRF คือ Blood clot ที่เกิดขึ้นในขบวนการแข็งตัวของเลือดตามธรรมชาติ แต่ตัดเม็ดเลือดแดงออกไป
การทำ PRF สร้างจากการเจาะเลือดจากเส้น vein ของผู้ป่วย draw ออกมา 10 cc. แล้วรีบนำมาใส่หลอดแก้ว จากนั้นนำไปปั่นในเครื่อง centrifuge ที่ความเร็ว 3000 rpm เป็นเวลา 10 นาที
หลังจากปั่นเสร็จ เลือดในหลอดจะแยกออกมาเป็น 3 ชั้น
ชั้นล่างสุดของหลอดเป็นสีเข้ม คือ ชั้นเม็ดเลือดแดง ชั้นบนสุดเป็น plasma ใส และชั้นกลางคือ PRF ที่เป็น clot นิ่มๆ เราสามารถให้ forcep คีบออกมาใช้ได้เลย (ก่อนใช้ต้องตัดชั้น clot ของ RBC ที่ติดมาด้วยด้านล่างออกไปก่อน จะได้ตามรูปที่เห็นครับ)
แล้ว PRF clot ที่ได้ ประกอบด้วยอะไรบ้าง?
ตอบว่า ประกอบไปด้วย Fibrin (ที่เกิดจากการ activate Fibrinogen ด้วย thrombin ใน Coagulation pathway ตามธรรมชาตินั่นเองครับ) Fibrin จะสานเรียงต่อกัน (polymerization) เป็น network ที่กัก Platelets จำนวนมหาศาลไว้
นั่นจึงเป็นที่มาของคำว่า Platelet Rich Fibrin (PRF)
ถ้าเราวาดรูปหลอดบรรจุ PRF ข้างบนใหม่ เป็นแผนภาพจะได้แบบนี้ครับ
แล้วส่วน Plasma ใสๆ ชั้นบนสุดคือ?
ในการ centrifuge โดยหลักพื้นฐานคือ การแยกอนุภาคออกจากส่วนที่เป็นของเหลว เมื่อเกิดการปั่น (หมุนหลอดทดลองด้วยความเร็ว) อนุภาคที่มีความหนาแน่นสูงจะตกตะกอนมากสุด และของเหลวที่ไม่มีอนุภาคปนจะอยู่ชั้นบนสุด
รูปแสดงการวางหลอดแบบสมมาตร (ตามจำนวนหลอดที่จะปั่น sample)
ชั้นบนสุดในที่นี้ จึงเป็นชั้น plasma ล้วนๆ ที่(แทบจะ) ไม่มี cell เจือปน จึงเรียก Acellular plasma หรือ Platelet Poor Plasma (PPP) เพื่อให้สอดคล้องและต่างจากชั้น PRF clot
ถ้าเรา classify การพัฒนาและต่อยอดของการมาถึงของเทคนิคการสร้าง PRF ที่มัน simple อย่างไม่น่าเชื่อ (คือ ไม่ต้องใช้สารเคมีใดๆ แค่เจาะเลือดแล้วนำมาเข้าเครื่อง centrifuge ให้เร็วที่สุด) จะต้องประหลาดใจ เพราะในตอนเริ่มแรกค่อนข้างยุ่งยากกว่านี้ ดังจะเล่าให้ฟังดังนี้ครับ
PRF ถือเป็น product ที่จัดอยู่ในการทำ Platelet concentration ใน Generation ที่ 2
คือแต่เดิมนั้น บรรพบุรุษของมันในยุคแรก คือ Fibrin glues และ PRP (Pletlet Rich Plasma) ครับ (ทั้ง Fibrin glues และ PRP จัดอยู่ในกลุ่มของ 1st Generation Fibrin adhesive ซึ่ง Fibrin glues เกิดขึ้นก่อนเทคโนโลยีการทำให้ Pletlet concentration อย่าง PRP)
เริ่มกันที่การสร้าง Fibrin glues ก่อน
ความรู้พื้นฐาน
Fibrin เป็น product สุดท้ายที่เกิดขึ้นในขบวนการแข็งตัวของเลือด
Fibrin เกิดจากการมัดรวมกันโดยการต่อสายของ Fibrinogen
Fibrinogen เป็นโปรตีนสายเล็กๆจำนวนมากที่อยู่ใน plasma และอยู่ภายใน alpha-granules ใน platelet โดยตัวมันเองเป็นโปรตีนที่ละลายน้ำได้ แต่เมื่อเกิด polymerization เป็น Fibrin แล้ว Fibrin จะเปลี่ยนเป็นโปรตีนชนิดที่ไม่ละลายน้ำครับ ความหนืดและเหนียวของ Fibrin จะดักจับ platelet (cell membrane ของ platelet มี receptor เฉพาะชนิดต่างๆ) ไว้ แล้วทำให้ alpha-granules ใน platelet เกิด degradation (platelet contraction) แล้วให้สารต่างๆ ที่เป็นโปรตีนออกมา เช่น Growth factor ต่างๆ และ cytokine
การผลิต Fibrin glues และ PRP คือการผสมสารตั้งต้นตามที่บริษัทผู้ผลิตเตรียมให้แล้วนำไปใช้เมื่อถึงเวลาที่ต้องการ
หัวใจของปัญหาของอยู่ตรงคำว่า “นำไปใช้เมื่อถึงเวลาที่ต้องการ”นี่แหละครับ
คำนี้ หมายถึง การจำลองขบวนการเกิด blood coagulation (ตามธรรมชาติ) ในขั้นตอนสุดท้ายให้ complete
คือใช้ Fibrinogen สำเร็จรูป + (bovine thrombin + CaCl2 = ตัว activate ให้ Fibrinogen เป็น Fibrin) + bovine Aprotinin (ทำให้ Fibrin ที่เกิดขึ้นมี life span ที่ยาวนานขึ้น)
การทำ Fibrin glues เราจะใช้ชุด Kit จากที่บริษัทเตรียมไว้ ประมาณว่าผสมสารหลอด A และ B เข้าด้วยกัน แล้วนำไปใช้ได้เลย
ขณะที่การพัฒนามาเป็น PRP นั้นจะมีความซับซ้อนขึ้นครับ
PRP หรือ cPRP (คำเรียก cPRP:concentrated Platelet-rich Plasma มีขึ้นเพื่อแยกความแตกต่างไม่ให้ไปสับสนกับการรักษาโรคทางระบบที่ต้องใช้ replacement therapy ด้วย plasma concentration อื่นๆ เพื่อทดแทนสารสำคัญในเลือดที่คนไข้ขาดหายไป เช่น Acute leukemia, Thrombopenia แต่เน้นว่าใช้สำหรับช่วยในการ Healing wound แบบที่กำลังอ่านในบทความที่ผมเขียนนี้เท่านั้นครับ)
การทำ PRP จะใช้การ centrifuge 2 ครั้ง โดยครั้งแรกเลือดที่ draw จากคนไข้จะเติมสาร anticoagulant เพื่อไม่ให้เกิดการแข็งตัวก่อน แล้วจึงนำไป centrifuge
จากรูปในหลอดแรก เลือดที่เราเติม anticoag แล้วปั่นจะแยกเป็น 3 ชั้น (ชั้นที่ 2 อยู่ตรงกลางน้อยมาก) ในหลอดนี้จึงไม่มี clot ใดๆ เกิดขึ้น
จากนั้นดูด plasma ในหลอดแรกไปสู่หลอดเปล่าอีกหลอด แล้วปั่นอีกครั้ง แต่ครั้งนี้จะ centrifuge ที่นานกว่า และแรงหมุนมากกว่าครั้งแรก plasma จะแยกชั้นอีกครั้ง สังเกตคราวนี้ชั้นที่ 2 จะหนาขึ้น (มี volume เพิ่มขึ้น)
ขั้นตอนสุดท้ายดูด plasma ชั้นบนออก แล้วนำชั้นกลางกับชั้นล่างสุด (ล่างสุดคือ RBC ที่หลงเหลืออยู่) เก็บไว้ (เก็บไว้ได้เพราะมันจะไม่เกิดปฏิกิริยาจน clot เพราะเราใส่ anticoag ไว้ตั้งแต่ตอนใส่หลอดที่ 1)
เมื่อจะนำมาใช้ เราจึงเติม bovine thrombin และ CaCl2 เพื่อให้เกิด clot ของ PRP (cPRP) เนื่องจากจะสังเกตว่ามีชั้นของเม็ดเลือดแดงปนมาด้วย PRP clot ที่ได้จึงมีสีชมพูปนเมื่อพร้อมนำมาใช้ (Rosy effect ของ Final PRP)
การเติม bovine thrombin และ CaCl2 จากภายนอก ทำให้ polymerization ของ Fibrinogen เป็น Fibrin เกิดขึ้นรวดเร็วกว่าที่เกิดจริงในธรรมชาติ ทำให้ Fibrin ที่ได้มีรูปแบบของ polymer ที่เปลี่ยนไปคือ
มันจะสานกันคล้ายการพันกันของสาย charge หูฟังโทรศัพท์ครับ เรียกการพันกันในลักษณะนี้ว่า Bilateral junctions หรือ Tetramolecular junctions (คือเกิดจุดเชื่อมต่อ 1 จุดที่มัดสาย 4 เส้นเข้าด้วยกัน)
Bilateral junction เกิดจากการผสม bovine thrombin เข้มข้นทำให้ polymerize อย่างฉับพลัน ได้เกลียวที่พันกันทางด้านข้างเกิดเส้น Fibrin ที่หนาและ rigid แต่เส้นที่เกิดไม่สามารถดักจับ cell หรือ สารต่างๆ ใน plasma ได้ จึงใช้เป็น glue ที่ดี (คือเหนียวและแข็ง ใช้ยึดหรือ seal แผลได้ดี)
แต่ Fibrin ที่ได้จากการทำ PRF ที่เราจะพูดถึงต่อไป เป็น Equilateral junctions หรือ Trimolecular junctions (1 จุดเชื่อมต่อสาย Fibrin 3 เส้น) เป็นลักษณะคล้ายตะแกรงหรือตาข่าย แบบนี้
ให้ลองนึกภาพตาข่ายของประตูฟุตบอล ที่สามารถดักลูกบอลเอาไว้ และมีความยืดหยุ่นเมื่อถูกยิงประตู ตาข่ายไม่ขาด
และด้วยคุณสมบัติความเป็นตาข่ายที่ flexible และ elastic ได้ดีมาก มันจึงแข็งแรงไม่ขาดง่าย ดัก cell (มี permeability), protein และ cytokine ได้ดี
คุณสมบัติการเป็นตาข่ายที่ยืดหยุ่นและดักสารต่างๆ ได้ดีนี้มีความสำคัญมาก เพราะทำให้เกิดการดูดซับและปลดปล่อยอย่างช้าๆ และยาวนานกว่า (ลองคิดสภาพการหายของแผลตามธรรมชาติที่ใช้เวลาหลาย week ถ้าเรามีวัสดุที่สามารถปลดปล่อยสารสำคัญเช่น growth factor หรือ cytokine ที่ควบคุมการอักเสบแบบช้าๆ ค่อยๆ ปล่อยไปพร้อมกับกาารหายของแผล จะดีแค่ไหน นี่คือ คุณสมบัติที่เราต้องการเลยทีเดียว)
แล้วการทำ PRF ทำอย่างไร?
ขั้นตอนคือ
1. เจาะเลือดจากเส้น vein ปริมาณ 10 cc –> 2.รีบนำเข้าเครื่อง centrfuge ปั่น 3000 รอบ/นาที 10 นาที–> 3.ได้ PRF พร้อมใช้งาน เสร็จเรียบร้อย
Close up ดูในหลอด
จะเห็นว่า ไม่ต้องปั่น 2 รอบ, ไม่ต้องเติมสาร anticoag ในหลอด, ไม่ต้องเติม bovine thrombin+CaCl2 ในครั้งสุดท้ายก่อนนำมาใช้
สรุปคือ ไม่ต้องใช้สารเคมีใดๆ เลย หัวใจสำคัญคือ การหาเส้น vein คนไข้ให้เจอ แล้ว draw เลือดออกมาใส่หลอดให้เร็วที่สุด ก่อนนำเข้าเครื่อง centrifuge แล้วปั่นด้วยความเร็วรอบและเวลาที่กำหนด เท่านั้น
ทำไม PRF จึงเป็น membrane กายสิทธิ์?
ให้ลองดูการนำ PRF มาใช้ใน clinic ทันตกรรม
1. เคสถอนฟัน แต่เราไม่ต้องการให้เกิดการ resorp ของสันเหงือกหลังถอน หรือเคสที่ถอน แล้ว plan ฝัง implant ใช้ PRF clot อัดเข้าไปใน socket แล้วทำเป็น PRF membrane ปิดทับ แล้ว suture
(อธิบายคือ PRF เป็น clot ที่เกิดขึ้นเหมือน clot ที่เกิดขึ้นในร่างกายเมื่อมีบาดแผล เพียงแต่ PRF clot คือ clot ที่เราเหวี่ยง centrifuge เอา RBC ออกไปเท่านั้น ดังนั้นมันจึงเป็น clot ที่มีลักษณะใส ยืดหยุ่น สามารถนำไปขึ้นรูปได้ การทำ PRF plug คือ การทำไปกดรูปใน mold โลหะ ให้เป็นก้อนเล็กๆ ใส่ใน socket แผลถอนฟัน หรือ ทำไปกดทับด้วย PRF box ให้ขึ้นรูปเป็นแผ่น membrane บางๆ มีความยืดหยุ่น เรากรีด,เจาะ,ร้อยด้วยไหม suture ได้
รูปแสดง PRF box
การใช้งานคือ เปิดฝาโลหะด้านบน แล้ววาง PRF clot เรียงตามจำนวนที่ต้องการ แล้วปิดฝากลับเพื่อให้เกิดการกดทับ ได้ clot ที่เปลี่ยนรูปเป็นแผ่นบาง คือ PRF membrane
สีแดงที่เห็น คือ RBC clot ที่หลงเหลือในส่วนรอยต่อของ PRF กับ RBC clot
หรือ จะใช้อีกรูปแบบ คือ นำ PRF clot ไปผสมกับ Allograft อย่าง Freeze dried bone หรือผสมกับ Autogenous graft อย่าง bone ที่ harvest มาจากกระดูกส่วนอื่น ทำให้เกิด sticky material ง่ายต่อ access การนำไป placement ในที่ต่างๆ )
การนำ PRF clot มาใช้ในรูปแบบต่างๆ ที่กล่าวมา ไม่ได้เกิดจากการ form Fibrin ที่เป็น network แบบ equilateral junctions คล้ายกับที่เกิดในธรรมชาติเท่านั้น (Fibrin network ที่เกิดจากการเติม chemical agent อื่นๆ เข้ามาจะไม่ได้ network แบบนี้ คือเกิดเป็น Bilateral junctions)
แต่ PRF clot ยังมีคุณสมบัติดักจับ cytokine อื่นๆ ที่มีอยู่แล้วใน plasma และ cytokine ที่ degradation จาก granules ของ platelet อีกด้วย
มี cytokine สำคัญที่มีบทบาท promote การ Healing และส่งเสริมการ migrate&proliferation ในฐานะ Growth factor 3 ตัวที่พบใน PRF clot คือ
TGFbeta-1 (Transforming Growth Factor beta)–>กระตุ้น proliferation ของ Osteoblast
PDGFs (Platelet-Derived Growth Factors)–> physiologic cicatrization (การ forming Scar)
IGFs (Insulin-like Growth Factors)–> ควบคุม proliferation&differentiation ของเกือบทุก cell type
พูดอีกอย่างคือ การใช้ PRF ไม่ได้มุ่งหมายไปที่การหวังผล Healing แบบธรรมชาติ, ควบคุม inflammation ขณะการหายของแผลเท่านั้น แต่หวังผลไปที่การรักษาโดยใช้แนวคิดของ Cell therapy ด้วยการใช้ Growth factors เลยทีเดียว (คือการนำ concept เรื่อง Regenerative dentistry มาใช้ เพียงแต่ไม่จำเป็นต้องมี Stem cell เพราะมี cell ที่ทำหน้าที่ได้เฉพาะเช่น Osteoblast ในบริเวณที่ทำงานอยู่แล้ว Concept นี้จึงใช้ Growth factor และ Fibrin network (matrix) ที่อยู่ใน PRF clot ทำหน้าที่ Scaffold เท่านั้น)
มาดูรายละเอียดว่า Fibrin network ที่ rich ด้วย platelet จะอยู่ในชั้นรอยต่อตรงกลาง ของ PRF
ใน Fibrin network มี Glycosaminoglycans (มาจาก blood และ platelet) ซึ่งมี strong affinity ต่อ platelet cytokine และยังช่วย support cell migration/healing process
ความสำคัญในข้อนี้คือ ความรู้พื้นฐานของเรารู้ว่า ภายในเลือดมีส่วนประกอบที่เป็น plasma และส่วนประกอบที่เป็น cell (RBC,WBC,platelet) ปนเปกัน สารต่างๆคือ protein,fibrinogen และ growth factor etc. มันจะละลายและแขวนลอยอยู่ใน plasma ด้วย
ทีนี้มันมีปัญหาว่า หลังจากเรา centrifuge ได้ RBC clot ในชั้นล่าง, PRF clot ตรงกลาง และ Plasma (ที่เป็น PPP(Platelet Poor Plasma) อยู่ชั้นบนสุด แน่นอนถ้าเรานำ PPP มาตรวจหา cytokine และ growth factor (โดยเฉพาะ TGFbeta-1,PDGFs,IGFs) จะเจอเพียบแน่นอน (เพราะมันมีละลายอยู่เดิมแล้ว centrifuge ไปก็ไม่มีผล มันมีความถ่วงจำเพาะต่ำจึงลอยชั้นบนเสมอ)
แต่ PRF clot ในชั้นกลางล่ะ จะพบ Growth factor พวกนี้หรือไม่? ถ้าพบ จะมีมากกว่าหรือน้อยกว่าในชั้น PPP)
คำตอบคือจากการศึกษา พบ growth factor ที่สำคัญเหล่านี้ในชั้น PRF clot ด้วย และมีปริมาณที่ไม่แตกต่างจากที่พบในชั้น PPP
ยิ่งกว่านั้นนอกจากพบเยอะแล้ว ยังเจอว่า มันใช้เวลา release factor เหล่านี้นานมาก
PRF clot จึงทำหน้าที่เสมือนเป็น matrix และ recipient ของ Growth factor
นอกจากนำไปผสมกับ grafting material อื่นๆ การนำไปใช้ในฐานะ Biomaterial
เช่น การทำ Sinus lift
การใช้เพื่อทดแทนขีดจำกัดของการใช้ Artificial membrane
จะเห็นว่า การเกิด Incision line opening ไม่เป็นปัญหาในกรณีนำ PRF membrane มาใช้แทน Goretex membrane
ในฐานะ Platelet concentration มาสู่ Biomaterial ที่ใกล้เคียง Ideal มาก PRF จึงน่าสนใจอย่างยิ่ง เพราะ ทำขึ้นได้ง่าย ใช้ได้ผลจริง และมีอนาคตการพัฒนาต่อที่สดใส
2.https://pdfs.semanticscholar.org/4a5a/fdae0b1790c33b439ffa4afed11a73486ee4.pdf
3.http://petrasgerve.lt/PRF_OOOE_2.pdf
4.https://m.youtube.com/watch?v=ypwXk805wFA&t=0s&list=FLpzxKaxf44rehKoNFfDQkGA&index=1
Dentdiary 